在白血病、淋巴瘤等血液恶性肿瘤中，调节性T细胞（Treg）作为一类具有关键免疫抑制功能的细胞群体，其数量和功能状态与疾病进展、治疗反应及预后密切相关。然而，Treg在外周血中含量极低，仅占CD4⁺ T细胞的1%–5%，且血液肿瘤样本中常存在大量单核细胞干扰，传统检测方法往往难以实现准确识别。

流式细胞术凭借多色荧光标记（如CD3/CD4/CD25/CD127）与Fc阻断技术的结合，可高效、特异地鉴定Treg细胞，显著提高检测灵敏度与准确性。

本文将详细介绍人外周血单个核细胞（PBMC）中Treg的流式检测全流程，涵盖样本制备技巧、染色方案与圈门逻辑，助你破解血液肿瘤免疫微环境中的“调控密码”。

Ficoll密度梯度离心是分离PBMC的金标准方法，可有效去除红细胞与粒细胞，保留高活性、高纯度的单核细胞群体，为后续流式检测奠定基础。

    关键步骤：

1. 样本稀释：推荐按1:1比例用PBS稀释全血，降低黏度、提高回收率；

2. 液面铺层：将稀释后血液缓慢加于Ficoll液面上，保持界面清晰，避免混匀；

3. 离心设置：400g、30分钟、20°C，升速1/降速0，⚠️注意：必须在常温下离心，防止血小板活化污染；

4. 吸取白膜层：离心后从上至下依次为血浆、PBMC层、Ficoll、粒细胞、红细胞，小心吸取PBMC层；

5. 洗涤去杂：使用PBS洗涤2次（500g → 300g，各10分钟），有效去除血小板与Ficoll残留；

6. 细胞计数：重悬后调整细胞浓度至1×10⁶ cells/管，备用于后续流式检测

Ficoll分离PBMC过程图

本研究采用表面标志物组合进行Treg鉴定，推荐如下抗体组合与染色流程：

    染色步骤：

1. 先染死活染料 : 用1X PBS 缓冲液将PBMC制成1x10⁶cells/ml 的悬液，离心，去除上清液；100uL含有 Live-Dead的PBS重悬细胞，染色30分钟。离心400g，5分钟，去除上清液。溶剂 FACS buffer洗一遍，离心，去除上清液。

2. Fc阻断 : 100ul FACS buffer重悬细胞，加入Fc抗体（按照说明书比例），冰浴10分钟。

3. 表面染色：用1Xpbs清洗细胞，400g，5分钟；加入100ul FACS buffer重悬细胞，按1：100的比例加入CD4、CD8、CD3等表面抗体，避光，4°C，30分钟。（每个抗体均设置单染管，用于调节补偿，抗体配色表如抗体配色表所示。）

4. 流式细胞仪上机 ：染色结束后， 400g，5分钟室温离心，去上清；加入1ml FACS buffer洗涤细胞， 400g，5分钟，去上清；加入200ul FACS buffer重悬细胞，即可进行流式检测。

    抗体配色表（推荐组合）：

 抗体配色表

顺利获得逻辑设门逐步筛选目标细胞群：

1. 基于SSC-A和FSC-A圈出人外周血免疫细胞中的淋巴细胞群和单核细胞群等；

2. 基于FSC-A和FSC-H圈出单细胞，去除粘连细胞；

3. 基于SSC-A和CD45圈出白细胞；

4. 在白细胞的基础上，基于CD3和CD19圈出T细胞；

5. 在T细胞的基础上，基于CD4和CD8圈出CD4⁺和CD8⁺ T细胞；

6. 在CD4⁺ T细胞的基础上，基于CD127和CD25圈出Treg细胞，其约占辅助T细胞的7.85%；基于CD38和HLA-DR，则分析出早期活化T细胞为19.4%；

7. CD3^-CD19^-的双阴性细胞群，既包含淋巴细胞群又包含单核细胞群，利用CD14/HLA-DR设门区分单核细胞、树突状细胞(DC)和粒细胞/NK细胞三类。粒细胞/NK群基于CD56/CD123圈出NK细胞 (60.2%)。

数据来源于Flowrepository：FR-FCM-Z8H9

1、血液新鲜程度是影响分离效果的关键因素，请尽量使用采集后24小时内的血液进行PBMC分离，粒细胞（Granulocytes） 在血液离体后随时间延长可能发生自发活化或分化，导致黏附性增强，与PBMC（外周血单个核细胞）共沉淀，污染PBMC层。

2、若后续进行PBMC细胞的分离培养，需使用肝素抗凝，而非EDTA抗凝，血小板易聚集，污染PBMC层；

3、 分离液使用时应始终保持室温（18℃-25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重；

4、 把血液样本加入到Ficoll溶液以后，红细胞会向下自然沉降这是正常现象。